BIOQUIMICA Y ALGO MAS

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares, aunque también se puede emplear con fines cuantitativos. Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran éstos. Para que se pueda emplear la técnica los núcleos deben tener un momento magnético distinto de cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número atómico par (como el 12C, 16O, 32S). Los núcleos más importantes en química orgánica son: 1H, 13C, 31P, 19F y 15N. Otros núcleos importantes: 7Li, 11B, 27Al, 29Si, 77Se, 117Sn, 195Pt, 199Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb Se prefieren los núcleos de número cuántico de espín nuclear igual a 1/2, ya que carecen

La primera detección de Resonancia Magnética Nuclear debida a la formación de una diferencia en las energías de ciertos núcleos en presencia de un campo magnético fue reportada por Bloch (para el agua líquida) y Purcell (para la cera de parafina) en 1946. La aplicación química de la RMN fue descubierta a principios de los cincuenta, al observarse que la frecuencia de resonancia de un núcleo dependía fuertemente de su entorno químico (chemical shift). A partir de los años setenta, el desarrollo de nuevas técnicas y mayores campos magnéticos (que incrementan tanto la sensibilidad como la resolución de las señales) permitieron estudiar moléculas cada vez más grandes. El advenimiento de la RMN multidimensional y el uso del marcaje 13C y 15N marcó el inicio de la RMN biológica.

Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la espectroscopía de RMN utilizó una técnica conocida como espectroscopía de onda contínua (CW). La manera de registrar un espectro de RMN en el modo de CW era, bien mantener constante el campo magnético e ir haciendo un barrido de frecuencias con un campo oscilante, o bien, lo que era usado más a menudo, se mantenía constante la frecuencia del campo oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magnético para encontrar las transiciones (picos del espectro). En la RMN de CW las señales del espectro se registran como señales en resonancia. La espectroscopía CW está limitada por su baja sensibilidad, ya que cada señal se registra una sola vez por cada barrido y la técnica de resonancia magnética nuclear ya es de por sí no demasiado sensible; esto quiere decir que la técnica sufre de una baja relación señal-ruido. Afortunadamente, en RMN es posible mejorar la relación señal-ruido mediante el promediado de señal. El promediado de señal co

La técnica de RMN con transformada de Fourier ( FT-NMR ) es la que se utiliza en los espectrómetros actuales. Uno de los pioneros en este campo es Richard R. Ernst, que la desarrolló a partir del año 1966 y por la que fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1991. FT-NMR permite disminuir drásticamente el tiempo que requiere adquirir una acumulación (scan) del espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido lento de la frecuencia, una en cada instante, esta técnica explora simultánea e instantáneamente todo un rango de frecuencias. Dos desarrollos técnicos fueron fundamentales para poder hacer realidad la técnica FT-NMR: ordenadores capaces de llevar a cabo las operaciones matemáticas necesarias para pasar desde el dominio de tiempo al de la frecuencia, es decir, para obtener el espectro; y el conocimiento sobre cómo poder excitar simultáneamente todo un rango de frecuencias. La FT-NMR funciona con la muestra (espines nucleares) sometida a un campo magnético externo c

La posibilidad de excitar la muestra con uno o más pulsos de radiofrecuencia (RF), cada uno de ellos aplicado con una potencia, duración, frecuencia, forma y fase particulares, e introducirlos en momentos específicos de tiempo durante el experimento de RMN, generalmente antes de que el sistema haya regresado al equilibrio por relajación, permite diseñar toda una gama de secuencias de pulsos de las que se puede extraer información molecular muy variada. Una secuencia de pulsos es una distribución en el tiempo de alguno o varios de los siguientes elementos: i) un cierto número de pulsos de RF que afectén a uno o más tipos de núcleos, ii) tiempos de espera en los que no se hace nada sino esperar a que el sistema evolucione de una determinada forma. Estos tiempos de espera pueden ser fijos o bien incrementables si su duración se va aumentando a medida que se repite el experimento. iii) gradientes de campo magnético y iv) una etapa final en la que se adquiere la FID. En un experimento de RM

La RMN en disolución es complementaria de la cristalografía de rayos X ya que la primera permite estudiar la estructura tridimensional de las moléculas en fase líquida o disuelta en un cristal líquido mientras que la cristalografía de rayos-X, como su nombre indica, estudia las moléculas en fase sólida. La RMN puede utilizarse también para el estudio de muestras en estado sólido. Si bien en su estado actual queda lejos de poder proporcionar con buen detalle la estructura tridimensional de una biomolécula. En el estado sólido las moléculas están estáticas y no existe, como ocurre con las moléculas en disolución, un promediado de la señal de RMN por el efecto de la rotación térmica de la molécula respecto a la dirección del campo magnético. Las moléculas de un sólido están prácticamente inmóviles, y cada una de ellas experimenta un entorno electrónico ligeramente diferente, dando lugar a una señal diferente. Esta variación del entorno electrónico disminuye la resolución de las señales y

Debido a que la intensidad de la señal de RMN , y por tanto, también la sensibilidad de la técnica depende de la fortaleza del campo magnético, desde los inicios de la RMN ha existido gran interés por el desarrollo de imanes más potentes. En la actualidad los imanes comerciales más potentes están en torno a los 22.31 T, o 950 MHz frecuencia de resonancia de 1H. Los avances en la tecnología audio-visual e informática también han mejorado los aspectos de generación de pulsos y la recepción de señal y el procesado de la información. La sensibilidad de las señales también depende de la presencia de núcleos magnéticamente-susceptibles a la RMN y, por tanto, de la abundancia natural de tales núcleos. Para el caso de biomoléculas los núcleos más abundantes y magnéticamente susceptibles son los isótopos de hidrógeno 1H y fósforo 31P. Por el contrario, núcleos como carbono y nitrógeno tienen isótopos útiles a la RMN, 13C y 15N, respectivamente, pero se presentan en baja abundancia natural. Para

Un espectrómetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales: Un imán que genere un campo magnético estable, el cual puede ser de una intensidad variable, definiendo la frecuencia de resonancia de cada núcleo. Generalmente se identifica cada espectrómetro por la frecuencia de resonancia del protón, así en un imán de 7.046 Tesla, los núcleos de 1H resuenan a 300 MHz, y por tanto sería un espectrómetro de 300 MHz. Una sonda , que se sitúa dentro del imán, en la que se introduce la muestra y que consta de las bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El número de bobinas y su disposición determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda. Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la parte electrónica del espectrómetro Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrómetro y con el que se analiza toda la información obtenida.

La aplicación fundamental de la espectroscopía de RMN es la determinación estructural, ya sea de moléculas orgánicas, organometálicas o biológicas. Para ello es necesario la realización de diferentes tipos de experimentos de los cuales se obtiene una determinada información. Para la elucidación estructural de moléculas orgánicas y organometálicas los experimentos más utilizados son los siguientes: Ejemplo de un espectro 1H de RMN. Espectro monodimensional de 1H: Da información del número y tipo de hidrógenos diferentes que hay en la molécula. La posición en el espectro (desplazamiento químico) determina el entorno químico del núcleo, y por tanto da información de grupos funcionales a los que pertenecen o que están cerca. La forma de la señal da información de los protones cercanos acoplados escalarmente. Ejemplo de un espectro APT, un tipo de experimento de 13C. Espectro monodimensional de 13C: Al igual que en 1H el desplazamiento químico da información de los grupos funcionales.